Si è visto che la combinazione di acido retinoico con insulina porta ad un differenziamento preferenziale, ma non selettivo, in senso adipocitario; oppure un cocktail di fattori di crescita somministrato a tempi diversi, -FGF e successivamente FGF2 e DGF) porta al lineage differenziativo di cellule neurali (oligodendrociti -sintetizzano la guaina mielinica nel SNC- e astrociti).

Si possono usare le cellule staminali embrionali a scopo terapeutico? In un lavoro si è usato un modello animale che manca di guaina mielinica (malattia di Pelizaeus-Marzbacher, oligodendrociti deficienti e non formanti normale guaina mielinica). Da cellule staminali embrionali murine si creano oligodendrociti; essi vengono trapiantati nei topi che sono privi di guaina mielinica. Per rendere visibili le cellule di origine embrionale esse sono state marcate con un marcatore specifico.

Altro esperimento: volendo curare il Parkinson ho bisogno di neuroni dopaminergici. Sono partiti da cellule staminali embrionali umani. Si hanno più stadi consecutivi, quindi si utilizzano cocktail di fattori di crescita (4 ng/ml di FGF2, giorno 4 si toglie FGF2 ottenendo i cosiddetti embrioni nipoti; al giorno 14, dopo 5 stadi, si ottengono i neuroni dopaminergici). Utilizzando fibroblasti come cellule nutrici e lavorando a stadi come detto, la percentuale di neuroni dopaminergici che si otteneva era molto ridotta. Si è così preferito l’uso di astrociti come feeder layer: isolati da due regioni diverse del cervello si è visto che solo gli astrociti isolati dal mesencefalo erano in grado di indirizzare il differenziamento delle cellule staminali embrionali verso il lineage neuronale dopaminergico.

Per verificare che effettivamente si trattava di cellule neuronali si utilizza la III-tubulina; i neuroni ottenuti nella coltura rappresentano il 40% circa del totale cellulare (vedi figura; la mix FGF2+FGF8+ Sonic hedgehog homolog (SHH) + Astriciti dà % maggiore di neuroni).

È stato poi analizzata la % delle cellule neuronali che fanno dopamina utilizzando come marcatore la miosina idrossilasi. Ed è stato visto che il 60% dei neuroni ottenuti (quindi del 40% sulle cellule totali) erano in grado di produrre dopamina.

Gli astrociti qui utilizzati provenivano da feti abortivi; tali astrociti sono stati resi immortali aumentando l’attività telomerasica (l’accorciamento dei telomeri, evento cardine per la senescenza cellulare, viene ridotto).

È stata poi anche analizzata la funzionalità di questi neuroni dopaminergici ottenuti. Neuroni dopaminergici umani vengono così trapiantati in modelli murini resi Parkinsoniani (danneggiamento dei neuroni dopaminergici), e si è visto che (con test comportamentali) si ha recupero funzionale dei neuroni danneggiati, nonché un recupero del comportamento degli animali rispetto all’animale di controllo non trapiantato.

Ma l’impianto di cellule neuronali dopaminergiche (quindi già differenziate da cellule staminali embrionali) ha qualche effetto collaterale? Non tutte le cellule neuronali trapiantate erano terminalmente differenziate, alcune erano in grado di incorporare la bromodeossiuridina (BrdU) o di esprimere marcatori per la divisione cellulare come la PCNA (vedi figura). Esse erano quindi in grado di proliferare. Ed avevano invece una down-regolazione dei marcatori del differenziamento terminale come l’istone H3.

Le cellule neuronali trapiantate andavano sì a colonizzare la regione del cervello, però analizzando la regione del trapianto si vede che ci sono cellule proliferanti nella regione più interna e non in quella più esterna. Probabilmente in questa regione non arrivano stimoli differenziativi, o magari potrebbe questa essere una regione ipossica che favorisce l’attivazione di patway proliferativi. Per ridurre cellule proliferative all’interno del trapianto si potrebbero somministrare al tessuto, e prima del trapianto, agenti citotossici che agiscono su cellule proliferanti (quelli usati nella chemioterapia x es), così da ridurre il potenziale rischio di trapiantare cellule proliferanti.

Altro esempio. Si vuole qui curare l’infarto. Si parte sempre da cellule staminali embrionali. Si è creato un costrutto che porta un gene per la resistenza alla neomicina sotto il promotore specifico cardiaco; tale costrutto viene inserito nelle cellule staminali embrionali, che verranno stimolate a differenziare (tolgo LIF così da down-regolere Nanog e OCT4). Si aggiunge neomicina e solo i cardiomiociti resisteranno all’antibiotico. Dopo la selezione le cellule possono essere impiantate in tessuto infartuato. Sarà però complessa l’applicazione nell’uomo, in quanto il costrutto ha un gene in più, la resistenza per la neomicina, che potrebbe sfuggire al controllo con i processi di ricombinazione.

Effetto collaterale dell’uso delle cellule staminali embrionali:

- potrebbero causare tumore;

- non sono self; funzionano quindi come il trapianto, il paziente deve quindi essere trattato prima del trapianto.