Utilizzando enzimi digestivi specifici si disaggregano le inner cellls mass della blastocisti; esse avevano comunque bisogno per cresce di un substrato, quindi di un feeder layer (cellule nutrici). All’inizio il feeder layer utilizzato era rappresentato da fibroblasti irradiati: l’irraggiamento non inficia la produzione di fattori trofici, ma limita il potenziale proliferativo, così da impedire il sopravvento dei fibroblasti (ricordiamo infatti che le cellule staminali hanno un basso rate proliferativo).

Importante fattore per la proliferazione delle cellule staminali è il fattore LIF (Leukemia Inhibitory Factor) è una citochina la cui presenza impedisce che le staminali differenzino nei tre foglietti germinativi. Nello specifico LIF favorisce l’espressione di due fattori di trascrizione, tipici delle staminali embrionali, OCT4 e NANOG. Quindi l’assenza di LIF down-regola OCT4 e NANOG, con successivo differenziamento spontaneo di queste cellule staminali verso i 3 linkege differenziativi (endo, ecto e mesoderma).

Quindi affinché una cellula staminale embrionale sia proliferativa e indifferenziata deve esprimere OCT4 e NANOG ad alti livelli, questo avviene avendo LIF nel mezzo di crescita. OCT4 e NANOG rappresentano i primi geni identificati come fondamentali per il mantenimento delle cellule indifferenziate, ma non sono certo gli unici. Attraverso esperimenti di interattomica (utilizzando OCT4 e NANOG) si è costruita una sorta di rete per identificare altri fattori chiave nel mantenimento delle cellule staminali embrionali. Attraverso analisi di DNA interference si è visto che alcuni fattori interagiscono direttamente, altri indirettamente con la proliferazione, la quiescenza, il differenziamento e la sopravvivenza delle cellule staminali.

Come è noto dall’ectoderma si originano molti tessuti, anche molto differenti tra loro. Ma come fa a dare origine per esempio alla pelle e allo stesso momento al cervello, come avviene quindi l’indirizzamento del differenziamento? Questo accade perché la regione dell’ectoderma che diverrà neuro ectoderma (diverrà tubo neurale e da questo neuroni e cellule della glia) ignora i fattori BNP. Se questo non accade l’ectoderma diviene epidermide (forse perché questa parte di ectoderma è più vicina alla zona di sintesi dei fattori BNP). Nel corso dello sviluppo comunque le cose variano, e per esempio il tubo neurale riconoscerà i fattori BNP per formare gli interneuroni.