In che modo rendere con un approccio metodologico una cellula self, che self non è? In questo ci ha aiutato l’embriologia classica, noi sappiamo quale processo di sviluppo presuppone la fusione dei gameti, che porta alla formazione del blastocisti e poi questa si impianta in utero.

Un modo è attraverso la tecnica del trasferimento nucleare (non clonazione terapeutica), che usa lo stesso principio della tecnica della clonazione riproduttiva, ma con delle differenze:  nella clonazione riproduttiva, noi non partiamo dai due gameti, ma utilizziamo soltanto la cellula uovo, che viene enucleata e al posto del nucleo si inserisce il nucleo della cellula prelevata da un paziente (ad es un fibroblasto) e, attraverso un meccanismo di riprogramming, si attiva il processo di segmentazione e si arriva allo stadio di blastocisti. Però quello che distingue la clonazione terapeutica da quella riproduttiva è che la clonazione riproduttiva teoricamente presuppone il fatto che la blastocisti generata è impiantata nell’utero di una femmina pseudo gravida per quindi portare alla formazione di un individuo clonato (come la pecora Dolly, che è stato il primo mammifero ad essere clonato nel 1996,che poi ha avuto un invecchiamento precoce. E questo è abbastanza logico a causa del fenomeno dell’imprinting genomico, che è fondamentale nelle prime fasi dello sviluppo embrionale, che porta al silenziamento dei geni materni o paterni . Nonostante attraverso la clonazione riproduttiva sia stato possibile attivare dei meccanismi di riprogramming, il nucleo di una cellula somatica non è in grado di avere le stesse potenzialità di un nucleo di un gamete).

Nel caso invece della clonazione terapeutica (per cui è più corretto parlare di un trasferimento nucleare), si utilizza sempre una tecnica simile, per cui si preleva il nucleo da una cellula somatica, come un fibroblasto del paziente, si inserisce nella cellula uovo enucleata, si arriva allo stadio di blastocisti, però questa invece di essere impiantata in utero, la usiamo per isolare le cellule della massa interna (embryonic  stem  cells) che sono in grado di differenziare,e quindi di ottenere la popolazione cellulare del paziente, oppure una “cassaforte” di cellule che il paziente potrebbe utilizzare nel momento in cui andasse incontro a delle alterazioni patologiche a livello di qualsiasi tessuto.

Descrizione di un esperimento:

si è partiti da un modello animale che aveva un difetto nell’ematopoiesi , in particolare un topo in cui era assente il gene Rag2, si sono prelevate le cellule somatiche, per esempio fibroblasti, quindi si è proceduto con l’isolare il nucleo da queste cellule, inserirlo in una cellula uovo enucleata,  attivando successivamente un processo di riprogramming nella cellula uovo in cui era stato fatto il trasferimento nucleare, e dalla blastocisti si potevano poi ricavare le cellule staminali embrionali. Però c’è un problema: pensate ad esempio ad una malattia genetica, prelevando il nucleo del paziente comunque la patologia rimane.  Quindi i ricercatori in questo esperimento non solo hanno ottenuto le cellule staminali, ma le hanno ingegnerizzate in vitro. Una volta isolate queste cellule Rag2 ^-- le hanno riparate con un approccio di gene therapy, quindi hanno inserito nelle cellule della blastocisti il gene mancante,  e a questo punto le hanno indotte a differenziare, le hanno selezionate per il gene Rag2, (non dovevano essere più rosse ma verdi, quindi in grado di accendere il gene Rag2 ). Una volta trapiantate per via sistemica nel topo si è visto che queste cellule erano in grado di fare un rescue del fenotipo malato e quindi di fare  nuovamente ematopoiesi.

Per le cellule staminale embrionali però non ci sono solo pro e contro scientifici (visti nelle prime ore della lezione), ma anche pro e contro politici (“cellule staminali politiche”), dovuti al dubbio che si debba o meno considerare la blastocisti persona, ma questi problemi li affronteremo alla fine del corso. Si potrebbe però pensare di considerare la blastocisti come un “donatore di organi”, ad esempio da utilizzare per scopi terapeutici ma anche di ricerca, mentre in Italia non si possono usare.

Per ovviare a questi problemi di natura etica, un modo sarebbe quello di impedire alla blastocisti di impiantarsi. Dalla embriologia sappiamo che l’embrione e l’endometrio della mucosa uterina devono comunicare, c’è un dialogo molecolare molto intenso, e se questo manca l’embrione non si impianta. In pratica utero ed embrione producono fattori, citochine, che permettono all’embrione di avvicinarsi e di prendere contatto con l’endometrio. Se manca questa comunicazione l’impianto fallisce ( e questo succede in molte gravidanze che non vanno a buon termine). Tra i geni fondamentali per l’impianto c’è CDX2 che è un gene importante appunto per permettere l’impianto dell’embrione nell’endometrio. Se si fa un’ablazione di CDX2, possiamo avere una blastocisti sanissima, ma che non è in grado di impiantarsi.  Quindi quello che si potrebbe fare per evitare problemi etici è di creare una blastocisti che sia difettiva per CDX2, non in grado di impiantarsi.

Un altro tipo di cellule che si collocano tra le staminale embrionali e le staminale adulte, sono le cellule staminali derivanti dal fluido amniotico, che possono essere multipotenti, cioè esprimono innanzitutto dei marcatori tipici delle cellule staminali, come c-kit, ma si è visto anche che se messe in coltura possono portare alla formazione di diversi tessuti  (adipociti, tessuto osseo, muscolo, neuroni, cellule del fegato…). Sono quindi considerate “staminali politiche” proprio perché potrebbero essere una valida alternativa alle cellule staminali della blastocisti dal punto di vista etico.

La ricerca sulle staminali embrionali ci ha fatto capire che ci sono dei geni che sono  fondamentali nel mantenimento di una staminalità, di una identità cellulare, e sono oct4 e NANOG. Questi due geni sono considerati, insieme ad altri, MASTER GENES. Questi, in generale, sono dei fattori di trascrizione in grado di attivare un determinato processo nelle cellule, sono cioè in grado di orchestrare un intero programma di espressione genica tessuto specifica in un qualsiasi tipo cellulare. Quindi oct4e NANOG sono i master genes delle cellule staminali embrionali che mantengono le cellule in questa condizione di staminalità. Un ricercatore giapponese (n.d.r  se ho capito bene dalla registrazione è Yamanaka) ha inserito questi geni in un fibroblasto, insieme ad altri due (che il prof non nomina) e ha ottenuto un risultato eccezionale: la conversione del fibroblasto in cellula staminale embrionale. Aveva quindi indotto una sorta di riprogramming nella cellula, ma senza trasferimento nucleare, bypassando uno dei problemi etici principali dell’uso delle staminali embrionali. Queste cellule sono state chiamate Induced Pluripotent Stem Cells (IPS), ed erano in grado di dare origine a tutti gli elementi principali dei tre foglietti germinativi, costituendo un elemento importantissimo sia dal punto di vista terapeutico ( ottendendo tramite una semplice biopsia cutanea una popolazione di fibroblasti e quindi una nostra popolazione di IPS personali) che di ricerca (per avere dei modelli sperimentali) e anche ovviando al problema etico. (gli autori dell’articolo hanno comunque scritto nella discussione che questa loro scoperta non avrebbe dovuto portare al blocco dei fondi per la ricerca sulle staminali embrionali, perché per arrivare a tale scoperta quel tipo di ricerca era stata fondamentale).

Ma queste cellule, sono veramente delle vere e  proprie cellule staminali embrionali?  Per verificarlo si possono reimpiantare in una blastocisti. I ricercatori hanno preso dei fibroblasti blu, b-gal⁺ , (che è un gene reporter, che quindi non apporta modifiche nelle cellule in cui è espresso, ma che ci permette di  seguire il destino differenziativo di una popolazione cellulare, perché portano alla colorazione delle cellule stesse. Ad es  b-gal colora le cellule di blu) , li hanno trasformati in IPS, li hanno inseriti in una blastocisti e l’hanno impiantata nell’utero di una femmina pseudo gravida di topo, e la cosa sorprendente è che si avevano pelle blu, muscolo cardiaco blu, rene blu, fegato blu, e questo significa che queste cellule, diventate staminali embrionali, si comportano come tali, dando origine alle popolazioni cellulari che formano i tre foglietti germinativi. A questo punto i ricercatori si sono chiesti se queste cellule fossero in grado di dare origine anche a cellule germinali e quindi partecipare anche alla gametogenesi. Hanno quindi incrociato i topi che avevano questi tessuti blu con individui wild type, e si è dimostrato che questi animali erano fertili e in grado di dare origine ad una progenie. Purtroppo in un lavoro del 2011, si è osservato, sempre per problemi legati al riprogramming, che queste cellule potevano presentare delle mutazioni, spesso in geni che se up-regolati erano  associati all’origine di un evento canceroso (questo è stato osservato in 22 cloni su cui i ricercatori stavano lavorando).

Vediamo ora le cellule staminali germinali, che sono quelle che danno origine ai gameti maschili e femminili.  In un altro lavoro pubblicato su Nature nel 2007, gli autori sono riusciti ad isolare le cellule staminali germinali, che sono pochissime, soprattutto partendo dai testicoli di ratto. Queste, messe in coltura, hanno delle potenzialità differenziative sorprendenti. Queste cellule isolate, esprimono un marcatore, che è GRP125 e sono in grado in coltura di differenziare nei componenti dei tre foglietti germinativi (ad es nell’ectoderma esprimevano la proteina gliofibrillare acida degli astrociti).  Le applicazioni terapeutiche di queste cellule staminali germinative, possono essere ad esempio quella di ristabilire la fertilità in pazienti sottoposti a chemioterapia, oppure nella ricerca di base di ottenere linee transgeniche, ingegnerizzando direttamente la staminale germinale, che poi andrà a fecondare la cellula uovo.

Passiamo adesso alle cellule staminali adulte. Nell’ ‘800, l’istologo Bizzozero, aveva già fatto delle osservazioni, notando che ci sono delle cellule dell’organismo che vengono rimpiazzate continuamente, e sulla base di questa osservazioni aveva suddiviso i tessuti in due grossi gruppi: tessuti labili (che si rinnovavano continuamente) e tessuti stabili (che non avevano questa capacità).  Egli pensava che questa facoltà fosse quindi limitata solo ad alcune parti dell’organismo e che ad esempio muscolo, o tessuto nervoso, non avessero questa caratteristica.  Egli ovviamente ancora non poteva parlare di cellule staminali.

Anche per le staminali adulte valgono gli stessi criteri che abbiamo visto per le cellule staminali embrionali:

• Sono clonogeniche
• Si dividono in modo asimmetrico (una cellula figlia resta staminale e l’altra invece va incontro al suo destino differenziativo)
• Hanno un basso rate proliferativo (proliferano più lentamente rispetto alle altre cellule, ma molto più a lungo)

Qual è il meccanismo molecolare che porta alla divisione asimmetrica delle cellule staminali?  Ciò che è emerso, osservando organismi semplici come Drosophila melanogaster (anche se in questo senso ci sono continui lavori che portano alla luce novità), è che questo processo avviene grazie al fatto che ci sono degli stimoli che permettono già a livello della formazione del fuso mitotico, di dividere i componenti cellulari e stratificarli in diverse parti. Prendiamo ad esempio i segnali della polarità (in verde nell’immagine che il prof mostra), e i segnali del destino differenziativo ( in arancio). Quando una cellula riceve uno stimolo alla divisione, questi elementi interni vanno a posizionarsi in modo diverso all’interno della cellula, quindi si stabilisce una polarità. Quindi i fate determinant vanno quindi a stabilirsi dalla parte opposta della cellula in divisione rispetto ai segnali che stabiliscono la polarità. Quando si forma il fuso mitotico, questo determina la divisone della cellula, ma non in due parti uguali, tranne che per i cromosomi. Le altre componenti citoplasmatiche non si dividono in modo simmetrico, quindi si formerà una cellula figlia un po’ più grande rispetto all’altra. E una cellula prenderà in eredità i fattori di polarità, ed è quella che manterrà la staminalità. L’altra invece, che ha preso in eredità i fate determinant, sarà quella che risponderà agli stimoli differenziativi. Entrambe le cellule, trovandosi nello stesso microambiente, riceveranno gli stimoli differenziativi, ma soltanto quest’ultima entrarà nel pathway differenziativo, mentre l’altra resterà staminale.  Ci sono ovviamente dei signalling, una trasduzione del segnale, che porta a questa divisione asimmetrica, e in particolar modo ci sono tre vie mediate da wnt, sonic hedge hold e NOTCH. Questo è stato scoperto soprattutto studiando la tumorigenicità, perché si è visto che diversi tumori hanno delle alterazioni in questi pathway, che portano ad alterazioni nella divisione asimmetrica. Infatti le cellule tumori geniche proliferano e si espandono in modo abnorme (ad es se NOTCH non è down regolato, come vedremo nelle prossime lezioni, questo è associato alla espansione del tumore).

Vediamo un esperimento che abbiamo fatto nel nostro laboratorio, per capire quale delle due cellule sta differenziando e quale invece è rimasta staminale. Si possono utilizzare due marcatori, NOTCH e NUMB, dove NUMB è un inibitore dell’attività di NOTCH.  Quindi normalmente la cellula che esprime NOTCH è una cellula proliferante, ed è solitamente associato a cellule staminali. Invece NUMB inibisce NOTCH, quindi inibisce la proliferazione, e soltanto la cellula che esprime NUMB può entrare in un pathway differenziativo.

Alcune cellule staminali adulte, come quelle ematopoietiche del midollo osseo, hanno anche un’altra importante caratteristica, cioè la plasticità di sviluppo, che le rende multi potenti. Possiamo definire la plasticità di sviluppo come quella caratteristica per cui, se prelevate dalla loro nicchia tissutale e costrette a risiedere in altre regioni del corpo,le cellule staminali adulte vanno incontro ad un destino proliferativo completamente diverso da quello originario. Ad esempio, se prendiamo le cellule staminali del midollo osseo e le costringiamo a risiedere in un altro distretto, ad esempio il muscolo cardiaco o scheletrico, queste cellule dovrebbero dimenticarsi di fare sangue e iniziare a fare muscolo cardiaco o scheletrico.  È quello che è stato fatto in un esperimento, per cui si è indotto un infarto in un modello animale (topo), e nella regione dell’infarto sono state impiantate cellule staminali ematopoietiche, e si è visto che c’era un recupero funzionale del miocardio infartuato.

Un’altra delle caratteristiche delle cellule staminali adulte è che molte di queste possono circolare, non solo quelle ematopoietiche che lo fanno quasi di mestiere. E questo dal punto di vista della rigenerazione dei tessuti può essere molto importante perché un tessuto avrebbe non soltanto le sue staminali residente (come le cellule satellite del muscolo), ma può anche utilizzare cellule che sono state reclutate dall’esterno.  Per fare uno studio di questo tipo sono stati irradiati dei topi, cioè è stato distrutto completamente il loro midollo osseo. Quello che è stato visto è che trapiantando le cellule staminale adulte ematopoietiche, i topi non solo ripristinavano il loro comparto ematopoietico, ma queste erano anche in grado di circolare, e infatti utilizzando un gene reporter, sono state trovate cellule blu anche in altri distretti tissutali.

Altra cosa che è stata osservata è che in assenza di danno,  se andiamo a fare una analisi citofluorimetrica e andiamo a cercare cellule che hanno dei marcatori  ematopoietici nel cuore o nel muscolo, in assenza di danno non troviamo delle grosse differenze. Provate invece a danneggiare un tessuto, e troverete delle popolazioni cellulari che non sono residenti, oltre alle staminali residenti che comunque fanno il lavoro più grosso. La presenza del danno, quindi ad esempio la necrosi del tessuto, fa si che arrivino nel distretto del danno le cellule dell’infiammazione (neutrofili, macrofagi), e arrivano anche le staminali. Questo perché nel distretto danneggiato sono prodotti i fattori di homing o di reclutamento, di cui molti ricercatori sono alla ricerca. Alcuni di questi  fattori sono sicuramente le citochine e probabilmente sono anche legati alla metastatizzazione dei tumori.  Per studiare questo fenomeno  si possono utilizzare dei geni reporter che colorano le cellule e farli esprimere sotto il controllo di un promotore tessuto specifico. E questo è stato fatto in uno dei primi esperimenti, in cui è stato creato un topo MLC/lac z positivo, che esprimeva un gene reporter, Lac z bg, sotto il controllo di un promotore muscolo specifico. Sono state prese delle cellule staminali ematopoietiche, quindi lac z negative (bianche, nel topo blu), le hanno trapiantate in un topo irradiato per via sistemica. Qualche settimana dopo hanno indotto un danno muscolare utilizzando il veleno di un serpente,  una cardiotossina, che induce necrosi nella regione del muscolo colpita. Il muscolo in qualche settimana comunque rigenera. L’esperimento ha quindi dimostrato, come atteso, che il trapianto di midollo nel topo era in grado di fare un rescue dell’ematopoiesi, ma sono stati trovato nuclei blu ( quindi di derivazione ematopoietica)  nella fibra muscolare. Quindi le cellule staminali trapiantate nel midollo per via sistemica, erano in grado di circolare, e di entrate nel compartimento muscolare se questo fosse stato danneggiato. Inoltre in piccola percentuale erano in grado di partecipare alla rigenerazione del muscolo danneggiato.

Un esperimento simile è stato usato utilizzando un promotore neurone specifico, e utilizzando come gene reporter  EGFP.  Anche in questo caso sono state trapiantate per via sistemica le cellule staminale ematopoietiche in un topo irradiato, e qualche settimana dopo è stato indotto un danno neuronale. E si è visto che le cellule trapiantate erano in grado in qualche settimana di formare cellule del Purkinje.

Ma questo è un processo che prevede il transidifferenziamento o la fusione? Perché per le cellule del muscolo parliamo comunque di un sincizio cellulare. Ma la cellula ematopoietica prima si differenzia e diventa satellite e poi fonde, o direttamente fonde con le cellule residenti? Per il muscolo non c’è molta differenza, ma per le cellule neuronali trovarle con due nuclei non è una cosa fisiologica. Ne discuteremo la prossima volta…

Ma la cosa interessante è che abbiamo una cellula tetraploide anche nel sistema nervoso (che non è fisiologicamente normale), e sappiamo che la tetraploidia è tipica delle cellule tumorali. Però si è osservato che il nucleo che deriva dalla cellula staminale ematopoietica, era stato istruito, riprogrammato, per comportarsi come una cellula nervosa, per cui i geni ematopoietici erano stato spenti e attivati solo quelli neuronali. Quindi dalla semplice fusione era stato fatto un rescue della cellula del Purkinje, anche se questa poteva avere ad esempio delle anomalie genetiche.