Cosa distingue una specie animale in grado di attivare processi rigenerativi da una specie animale che non è in grado di farlo?

Passando ad organismi sempre più complessi, come i mammiferi, continuiamo a vedere un silenziamento dei processi rigenerativi visualizzati negli organismi inferiori. Sebbene però i mammiferi non siano in grado di rigenerare un arto amputato non è vero che non sono in grado di attivare processi rigenerativi: nel processo di wound healing, in base al tipo di ferita, la funzionalità nel punto del taglio viene ripristinata nel giro di 3 settimane. Se in seguito ad un trauma si va incontro a degenerazione a livello di tessuti come il muscolo scheletrico o l’osso, nel giro di settimane o mesi, si è in grado di recuperare non solo la morfologia e la struttura, ma anche la funzione. Nella scala evolutiva, noi organismi superiori, abbiamo perso un po’ di efficienza nei processi rigenerativi.

In alcune specie di anfibi possono essere rigenerati arti, cuore, midollo spinale, retina che nelle specie superiori non vengono affatto rigenerata in maniera così efficiente.

 

Meccanismi successivi all’amputazione dell’arto:

A livello della regione di amputazione, che chiameremo blastema, si formano delle cellule che derivano dal dedifferenziamento di tessuti terminalmente differenziati e che sono in grado di tornare indietro. Anche neuroni e cellule del muscolo scheletrico (sincizi polinucleati) dedifferenziano e rientrano nel ciclo cellulare. Ad oggi questo processo nei mammiferi non è stato ancora trovato ma non è detto che non potrà mai avvenire (non ci sono dogmi nella scienza).

Ciò quindi che distingue una specie animale in grado di attivare processi rigenerativi da una specie che non è in grado di farlo è la formazione del blastema.

Il blastema lo troviamo in una regione danneggiata del corpo quando i tessuti rimasti vanno incontro a dedifferenziazione, ciclo cellulare e devono poi rientrare di nuovo in un pathway differenziativo. Si devono formare nuovamente, nel caso di un’amputazione, tessuto muscolare, terminazioni nervose, tessuto osseo, cartilagine e pelle.

Molti dei meccanismi che sono alla base della rigenerazione tissutale non sono altro che la ricapitolazione, in tempi molto più ristretti di quello che succede nel corso dello sviluppo embrionale.

La rigenerazione, da un punto di vista evolutivo, la possiamo definire come un tratto ancestrale (che troviamo nell’hydra, nella planaria, negli anfibi e nei rettili) che è stato silenziato in alcune specie (uomo e mammiferi) nel corso dell’evoluzione.

 

Un tentativo per andare ad attivare i processi rigenerativi in specie che normalmente sono difettive è quella di attivare la formazione del blastema. Anche nelle specie animali che rigenerano, se viene a mancare il blastema non c’è rigenerazione.

Normalmente a livello della regione di amputazione si deve formare una sorta di tappo di chiusura. Questo coaugulo è formato da uno strato di cellule epidermiche ed è la “conditio sine qua non” per la formazione del blastema. Se si blocca con una garza la regione di amputazione e si impedisce alle cellule di ricoprire la regione di amputazione il blastema non si forma. Subito dopo la formazione dello strato di cellule epidermiche avvengono tutti i meccanismi di dedifferenziamento. Una volta tornate indietro e rientrate nel ciclo cellulare le cellule formano il blastema.

 

Sono state avanzate tre teorie principali per spiegare la formazione del blastema, per spiegare anche in che modo il blastema da origine ai diversi elementi tissutali che devono rigenerare per poter rimpiazzare l’arto amputato o la regione danneggiata.

Tutte e tre le teorie si basano sul fatto che le cellule terminalmente differenziate tornano indietro, dediferenziano. È importante capire anche quali sono i meccanismi che istruiscono queste cellule a rientrare nuovamente in un pathway differenziativo.

Le cellule che sono tornate indietro mantengono la memoria differenziativa? (una cellula muscolare che è tornata indietro e non è più sinciziata, quando è indotta a differenziare, si ricorda che era mioblasto e ri crea fibra muscolare oppure perde la sua memoria differenziativa?)

Teorie:

1. Tutte le cellule sono ristrette nel loro lineage differenziativo, quando tornano indietro mantengono la loro memoria differenziativa. Sono indirizzate nel loro specico lineage. Questa ipotesi però non è del tutto vera perché si è osservato che a livello dell’arto amputato ci sono elementi cellulari che una volta dedifferenziati (miotubi) possono contribuire a formare la cartilagine. Non è vero che tutte le cellule sono ristrette nel loro lineage differenziativo e mantengono la memoria.

 

1. Tutte le cellule sono in grado di tornare indietro ed acquisire pluripotenza: perdono la loro memoria differenziativa, una cellula che era muscolo fa cartilagine, un cheratinocita è in grado di fare nervo, muscolo o osso. Anche questa teoria della “tabula rasa” non è propriamente esatta perché i primi elementi cellulari che sono coinvolti per consentire la formazione del blastema sono proprio i cheratinociti: sono i primi che vanno a ricoprire la regione di amputazione.

 

1. Esiste un mix di popolazioni cellulari. Molte cellule mantengono una loro memoria differenziativa (cheratinociti) ma esiste anche una buona percentuale di cellule che diventano altamente plastiche: hanno acquisito, una volta de differenziate, una capacità di sviluppo che non avevano all’inizio, perdono la memoria differenziativa e diventano pluripotenti. Rappresentano le prime cellule staminali, anche se all’epoca di questi esperimenti ancora non si parlava di cellule staminali.

 

La teoria più accreditata è la terza che stabilisce un mix di cellule che mantengono la loro identità e cellule che dedifferenziando acquisiscono un’alta capacità di sviluppo.

 

Sequenza dettagliata eventi nella rigenerazione dell’arto amputato:

 

• Prime 48ore: nella regione di amputazione il primo elemento che si forma è il sottile strato di epidermide formato esclusivamente da cheratinociti. In questa regione troviamo ancora tessuti terminalmente differenziati (osseo, muscolare) e c’è ancora una corretta organizzazione strutturale.
• 7 giorni: il quadro istologico è completamente diverso. Sono poche le regioni in cui i tessuti rimangono ancora differenziati e organizzati. Ancora non si è formato il blastema vero e proprio.
• 14 giorni: cominciamo ad osservare il blasetema. Le cellule de differenziate entrano in ciclo, formano cellule perfettamente proliferanti, hanno già perso l’identità differenziativa.
• 18giorni: regione ampia del blastema ancora più evidente. Formazione di cellule mononucleate e la quasi totale scomparsa di tessuto terminalmente differenziato.
• 24 giorni: allungamento del blastema nelle regioni più vicine alla sede di amputazione e tende a colonizzare anche le regioni più distali.
• 35-40giorni: riorganizzazione dell’arto. Le cellule che erano rientrate nel ciclo cellulare, escono ed entrano nuovamente in un percorso differenziativo. Si riformano gli elemnti scheletrici, il tessuto muscolare e le terminazioni nervose.
• 42-45 giorni: formazione dell’esatta copia dell’arto.

 

 

Il sistema nervoso deriva dall’ectoderma da cui derivano anche: la cute, la ghiandola mammaria, i peli, lo smalto dentale .

mesoderma : muscolo scheletrico , vasi sanguigni, musc cardiaco, cell del sangue

Endoderma : intestino pancreas…ecc.

Ma in che modo da un unico foglietto germinativo si originano tipologie cellulari così differenti dal punto di vista funzionale e strutturale?

Le cellule dei tre foglietti germinativi sono le cellule che a seguito della gastrulazione ( detta anche transizione epitelio-mesenchima),intraprendono destini differenziativi diversi.

Ma chi le istruisce nel loro percorso differenziativo, chi decide che una cellula dell’ectoderma deve diventare neurone o una ghiandola mammaria?

Ci sono dei segnali molecolari di induzione al differenziamento.

Ad esempio:

Nell’ectoderma , durante la formazione del Sistema nervoso, c’è un gradiente di fattori di crescita della famiglia del Tgfβ , chiamati BMP ( bone morphogenetic protein) inizialmente descritti nel sistema scheletrico, si è visto che sono coinvolti anche in altri sistemi e nello sviluppo embrionale.

Le cellule dell’endoderma che rispondono al BMP diventeranno epidermide , mentre le cellule che non rispondono a questi fattori , che sono lontane dalla sede di secrezione cellulare, sono quelle che diventeranno neuroectoderma da cui si svilupperà il tubo neurale.

Dal tubo neurale derivano tutti i neuroni e parte della glia ( astrociti, oligodendrociti e ependimociti).

Nella fase iniziale di differenziamento c’è un gradiente di morfogeni per garantire un primo corretto differenziamento ectodermico in epidermide o neuroectoderma.

I fattori BMP saranno fondamentali per il differenziamento di parte del neuroectoderma nelle diverse tipologie neuronali.

il tubo neuronale presenta :

una porzione dorsale -> roof plate dalla quale si originano gli interneuroni

Una porzione ventrale -> floor plate dalla quale si originano i motoneuroni.

 

Una volta formato il tubo neurale i fattori BMP si localizzano a livello della regione dorsale e sono quelli che specificano gli interneuroni , mentre a livello basale(più a contatto con la notocorda) c’è una produzione di altri fattori come Sonic-Hedgehog ( Shh) sempre con un gradiente che condiziona la regionalizzazione delle diverse porzioni nel corso dello sviluppo.

 

Ci sono tre ipotesi relative alla modalità di segnalazione molecolare che guida la rigenerazione :

l’ipotesi del gradiente di morfogeni , che potrebbe essere accettabile anche se è difficile immaginare che ci siano delle concentrazioni così alte di morfogeni in una regione piuttosto che un'altra in un arto amputato.

La seconda ipotesi è quella di una stratificazione di morfogeni, che sono tutti allineati e diversi tra loro.

L’ipotesi più accreditata si basa su una produzione random di morfogeni, basata sui segnali cellulari e in base alla crescita dei diversi elementi tissutali .

 

L’acido retinoico è uno di questi morfogeni coinvolti nella rigenerazione dell’arto amputato.

Quale esperimento possiamo fare per capire quanto un morfogeno condizioni lo sviluppo di una regione? L’acido retinoico è importante per la prossimalizzazione, in condizioni normali ( A) abbiamo uno sviluppo fisiologico dell’arto , dopo trattamento con acido retinoico abbiamo la prossimalizzazione anche delle regioni più distali alterando il corretto sviluppo dell’arto. Quindi ci sono dei segnali che sono prodotti nelle regioni dell’arto amputato che condizionano il corretto sviluppo dell’arto.

Altro esperimento :

Se trapiantiamo il mesoderma non segmentato a destino toracico e lo trapiantiamo nella regione cervicale si ottengono delle vertebre toraciche nella regione del collo.

 

Tra i fattori che partecipano al corretto sviluppo del corpo sia nello sviluppo embrionale che nel processo rigenerativo ci sono i geni Hox , si parla infatti di un codice Hox di omeogeni che è stratificato nelle diverse regioni ed è coinvolto nello sviluppo degli elementi scheletrici ad es per la specificazione dell’osso a livello dell’omero sono coinvolti i geni hox 9 e 10.

La stessa cosa è stata descritta andando a studiare l’amputazione della coda e dell’arto negli urodeli

Nel corso della rigenerazione viene ricapitolato lo stesso pattern di espressione che si osserva nel corso dello sviluppo embrionale .

Esempio di espressione di un omeogene : loxP13 viene espresso nella coda, negli arti anteriori ma non nei posteriori . Nella rigenerazione la regione di amputazione ( sia anteriore che posteriore)esprime questo gene hox ( il quale controlla la proliferazione e l’identità cellulare in queste regioni) infatti è particolarmente espresso nella regione del blastema.

Quando cominciano a redifferenziare nelle regioni più distali perdono l’espressione di loxP13 che rimane nelle regioni meno differenziate. Lo spegnimento di lox rappresenta l’evento molecolare dell’inizio del differenziamento.

 

Dobbiamo rispondere ad una terza domanda, quali sono i meccanismi molecolari e le pathway coinvolte nella formazione del blastema?

 

Alcuni studi iniziano a chiarire quali sono i meccanismi alla base della formazione del blastema e che regolano il corretto sviluppo delle regioni amputate:

Pathway di Wnt/β-catenina -> interviene in moltissimi processi come il corretto differenziamento delle cellule staminali.

È importante capire come viene regolato un pathway molecolare tramite modificazioni post tradizionali e come l’alterazione di queste modificazioni porti ad alterazioni patologiche .

Come è stato studiato il pathway di Wnt/b catenina?

Tramite KO ,inibizione farmacologica nell’adulto, KO condizionale con cre-lox.

Nel caso preso ad esempio si è utilizzato un approccio sia farmacologico e genetico

si è trattato l’arto amputato con axina ( inibitore farmacologico di Wnt) si forma un moncherino e non si assiste a rigenerazione dell’arto amputato .

si prende un animale che presenta un alterazione del pathway e aggiungendo b catenina ci rendiamo conto che è in grado di bypassare l’alterazione.

Se facciamo un amputazione e poi si inibisce il pathway di Wnt non si avrà rigenerazione .

 

La rigenerazione della coda è processo molto particolare ed interessante da prendere in considerazione perché comporta un alterazione non solo dell’epidermide ma anche del midollo spinale.

Ci sono tre teorie che spiegano il processo di rigenerazione ( in entrambi i casi le cellule risiedono, in partenza nel midollo spinale):

Esistono due diverse popolazioni cellulari che sanno già quale strada differenziativa dovranno intraprendere , ma l’attivazione del differenziamento inizia solo in seguito a stimoli specifici .

Una tipologia cellulare si trova nella nicchia del midollo spinale e vi rimane indifferenziata fino a che , a seguito dell’amputazione, entrerà in contatto con la nicchia muscolare e sarà indotta a differenziare a seguito di segnali miogenici formando strutture muscolari.

Non c’è una distinzione a monte delle due diverse popolazioni, ci sono popolazioni con un alta plasticità di sviluppo che possono intraprendere entrambi i cammini. Possono ricevere dei segnali già all’interno del midollo spinale , a seguito di un amputazione, che le indirizza verso un differenziamento miogenico che si completerà nel muscolo .Specificazione dell’identità muscolare all’interno del midollo.

L’identità differenziativa la cellula plastica la acquisisce solo quando entra nel compartimento muscolare ( molto simile alla 2 teoria)non prima nel midollo spinale

 

Il dedifferenziamento è alla base della formazione del blastema. E questo si è visto anche in coltura : se si prendono delle cellule mononucleate e si mettono in coltura fanno il miotubo. In seguito a danno , le cellule sinciziali rientrano nel ciclo e questo processo presuppone una redistribuzione dei nuclei, la formazione di cellule mononucleate , il rientro nel ciclo cellulare e un ‘espansione della popolazione cellulare.

La domanda centrale da porsi è : chi decide che alcune cellule devono dedifferenziare e rientrare nel ciclo cellulare?

Il fattore chiave del ciclo cellulare è Rb . meccanismo : in una cellula quiescente Rb è sequestrato ed inibito dal suo inibitore E2F, l’attivazione è mediata da fattori di crescita che attivano delle pathway e determinano la de fosforilazione di Rb e l’entrata nel ciclo cellulare.

Il problema è dedifferenziare e poi entrare nel ciclo in maniera localizzata a livello cellulare. Il dedifferenziamento è garantito dal TDA, fattore di attivazione della trombina , che viene attivato solamente nelle specie che formano il blastema.